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各市农业农村局(农业局、农委、水产畜牧兽医局）：

　　当前我区非洲猪瘟防控形势十分严峻，为进一步加强全区非洲猪瘟排查、检测力量，全面做好非洲猪瘟防控工作，根据《农业农村部办公厅关于做好非洲猪瘟实验室检测工作的通知》（农办牧〔2018〕54号）及《自治区农业厅办公室关于开展非洲猪瘟实验室检测能力比对工作的通知》(桂农业办函〔2018〕167 号)精神，我厅委托自治区动物疫病预防控制中心组织全区14个地级市动物疫病预防控制中心兽医实验室进行非洲猪瘟检测技能的培训和比对验证工作，比对结果全部通过验证，均具备非洲猪瘟检测能力。据此，我厅批准确认全区14个地级市动物疫病预防控制中心兽医实验室（名单详见附件1）具备非洲猪瘟检测能力。现就开展非洲猪瘟实验室检测有关工作要求如下：

　　一、从发文之日起，全区14个地级市动物疫病预防控制中心兽医实验室负责所辖区内非洲猪瘟实验室检测相关工作。

　　二、检测规程参照 “非洲猪瘟实验室检测操作程序”（附件2）的要求进行非洲猪瘟病原检测，检测阳性样品或可疑样品送自治区动物疫病预防控制中心进行复核。

　　三、所有开展检测的实验室要严格按照生物安全二级实验室的要求进行相关活动，避免二次污染，同时做好实验室人员防护工作 。

　　附件: 1.全区具备非洲猪瘟检测能力的实验室名单

　　2.非洲猪瘟实验室检测操作程序

　　广西壮族自治区农业农村厅办公室

　　2019年2月26日

　　附件1

　　全区具备非洲猪瘟检测能力的兽医实验室名单

　　附件2

　　非洲猪瘟实验室检测操作程序

　　一、 目的

　　规范非洲猪瘟实验室检测的标准操作程序，保障检测活动的顺利开展和实验室的生物安全。

　　二、 适用范围

　　适用于临床样品中的非洲猪瘟病毒核酸检测。

　　三、 操作程序

　　严格遵守监测方案中的生物安全防护要求，检测活动应该在生物安全二级或以上实验室中开展，严格在生物安全实验室和生物安全柜中对样品进行处理和灭活，避免发生溢撒、泄漏等生物安全事故。

　　（一）样品处理。

　　1. 全血样品

　　采用自然析出或离心方式获得血清，将血清移至新的样品管密封好后标记编号。

　　2. 抗凝血样品

　　取抗凝血样品1mL至新的样品管中，密封后标记编号。

　　3. 组织样品

　　（1）用灭菌的1× PBS（0.01M，pH7.2）中制备10%组织匀浆液。

　　（2）以1050 g（或2000转/分）离心10分钟。

　　（3）将上清液移至新的样品管中，密封后标记编号。

　　4、饲料样品

　　（1）小心打开装有饲料的包装袋，取0.1-0.2g饲料，放入2ml EP管中，加入1ml PBS 缓冲液（0.01mol/L，PH7.2），盖紧管帽，轻轻震荡混合，将EP管中的饲料与PBS充分混匀后以10000rpm离心1min，取上清备用，如在PBS重悬时粘稠度太高，可加入1粒灭菌钢珠，经组织研磨仪研磨后，离心取上清备用。

　　5. 病毒灭活

　　将前述预处理好的样品放入60 oC水浴中灭活30分钟，期间每隔5分钟颠倒混匀样品一次。

　　（二）病毒核酸提取。

　　本操作规程所推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为PCR 检测方法的一般性指南，最佳反应条件（如反应时间和温度、设备型号和厂商、引物和dNTP 等试剂的浓度等）可随实验室不同而稍有变化，使用前应首先评估这些条件。

　　1. 试验材料

　　（1）待检样品。

　　（2）DNA 提取试剂盒High Pure PCR template Preparation Kit (Roche 公司产品)，可使用其他效果相似的病毒核酸提取试剂盒代替，也可使用自动化提取设备。

　　（3）每次核酸提取过程中应至少设立提取阳性对照（E +）和提取阴性对照（E–）各一个。

　　2. 设备与材料

　　台式高速冷冻离心机、冰箱、冰柜、金属浴、移液器等；移液器吸头（1-20、20-200 和200-1000 μL）、灭菌离心管（0.2、0.5、1.5 和2 mL）、乳胶或丁腈手套；无水乙醇、异丙醇、无DNase 和RNase 水（非DEPC 处理水）。

　　3. 操作步骤

　　以Roche 公司的High Pure PCR Template Preparation Kit 为例。

　　（1）试剂准备

　　冻干蛋白酶K：将蛋白酶K 溶解于4.5 mL 灭菌蒸馏水中，将溶液以每管500 μL 分装，在–20 oC 储存，直到使用。

　　除抑制物缓冲液：将20 mL 乙醇加入原瓶（黑色瓶盖）中并进行相应的标记和日期记录。室温下储存。

　　冲洗缓冲液：将80 mL 乙醇加入原瓶中（蓝色瓶盖）并进行相应的标记和日期记录。室温下储存。

　　（2）将200 μL 结合缓冲液（绿色瓶盖）以及40 μL 蛋白酶K（20 mg/mL）分别加入到1.5 mL 离心管中。

　　（3）每管加入200 μL 样本。每次提取程序均需设立至少一个E +和E–对照。立即混匀并在72oC 下孵育10 分钟。

　　（4）将1.5 mL 离心管瞬时离心，除去管盖和管壁内的液体。

　　（5）每管加入100 μL 异丙醇。

　　（6）将过滤管放入收集管中，将所有样本移入过滤管。

　　（7）将样品以8000 转/分离心1 分钟。如果样品依然留在过滤管中，重复离心操作。

　　（8）弃去收集管，将过滤管插入到干净的收集管中。

　　（9）将500 μL 除抑制物缓冲液放入过滤管，以8000 转/分离心1 分钟。

　　（10）弃去收集管，将过滤管放入干净的收集管中。

　　（11）将450 μL 冲洗缓冲液加入过滤管，以8000 转/分进行1 分钟离心操作。

　　（12）弃去收集管，重复冲洗步骤。

　　（13）弃去收集管，将过滤管放入干净的收集管中。以13000 转/分离心10 秒钟，以去除残余的冲洗缓冲液。

　　（14）弃去收集管，将过滤管放入干净的1.5 mL 离心管中。

　　（15）核酸洗脱，将50 μL 预热（72°C 左右）的灭菌蒸馏水加入过滤管（注意不要使用试剂盒中的洗脱缓冲液），以8000 转/分离心1 分钟。

　　（16）将DNA 提取物在–20 oC 温度下储存（有效期12 个月），以备将来使用。如果将在1-2小时内用于PCR 操作，则在4 oC下储存。

　　按照生物安全要求将提取的核酸进行下一步检测。

　　（三）实时荧光PCR 检测。

　　1. 设备与材料

　　冰箱（–20 oC，–70 oC 和4 oC）；乳胶或丁腈手套；离心机；0.5 mL、1.5 mL 和2 mL 的离心管；容量0.2 mL或0.1 mL的PCR管/板（光学级）；荧光PCR仪；单道移液器（1-10 μL，10-100 μL，10-200 μL，200-1000 μL）；掌上离心机；震荡混匀器等。

　　2. 试剂

　　（1）探针法荧光PCR试剂盒，可从Thermo Fisher Scientific 公司、Qiagen 公司或其他公司购买具有效果相似的试剂盒。

　　（2）TaqMan 探针，稀释至工作浓度10μM，分装后在–20 oC 下避光储存，有效期1 年。

　　（3）引物，稀释至工作浓度为10μM，分装后在–20 oC 下储存，有效期1 年。

　　（4）无DNase/RNase 的水，PCR 级别。

　　（5）阳性和阴性对照：每次PCR 检测中需包括提取阳性对照（E+）和提取阴性对照（E–）、反应阳性对照（R+）和反应阴性对照（R–）。

　　3. 方法

　　本方法扩增ASFV VP72 基因的DNA片段。PCR以20 μL体系进行；反应液制备完成后，每管加入2 μL DNA样本。

　　3.1 反应液制备

　　在灭菌的1.5 mL 离心管中制备符合试验样本数量（包括E+、R+、E– 和R–对照）的PCR 反应混合物，至少额外制备两个样本的量。